核酸、蛋白质等微量紫外吸光度测量的应用方案

多家生命科学领域的实验设备供应商已将海洋光学的微型光纤光谱仪应用在了其微量或者超微量紫外分光光度计设备中，并实现了全波段200-850nm，或者单波段260、280nm处，2ul以下单链核酸（dsDNA）、双链核酸（ssDNA）、RNA、蛋白质、荧光探针标记物、糖类、醛类等生物大分子以及细胞培养液等的紫外及可见吸光度和浓度的检测，测量精度达到±0.001Abs，重复精度达到±2%，实现定量的浓度范围达到0.05-4000ng/ul，甚至到10，000ng/ul，波长精度达到2nm以下，吸光度值测量的范围0-80Abs，甚至到500Abs。可以应用在对这些物质的检测中，海洋现有客户，已使用海洋光学光谱仪，测到微量核酸、蛋白质样品的紫外吸光度。样品体积0.5-2.5ul的核酸浓度检测、荧光标记探针检测、蛋白质浓度检测、比色法蛋白浓度检测、糖类、醛类等生物大分子检测和细胞培养液检测。

图1. 鲑鱼精子DNA吸光度检测结果

半个世纪以来，生命科学各领域取得了巨大的进展，由于20世纪50年代DNA双螺旋结构模型的发现，人类找到了组成生命的基本单元，对人类基因组20%的测序已达到99.99%的准确率和完成率，今后将要继续发现于阐明大量新的重要基因，诸如控制记忆与行为的基因，控制细胞衰老与程序性死亡的基因，新的癌症基因与抑制癌症的基因，以及与大量疾病有关的基因。20世纪70年代后，分子生物学的发展，以基因工程为代表的生物工程的出现，生物技术通过对DNA链的精确切割与有目的地重组，使有目的地改良生物的性状与品质成为可能。在所有这些生命科学的重大研究内容中，基因、蛋白质、荧光标记物以及细胞培养液等物质的定性与定量表征则是对各类生物工程、医药病理研究的关键内容。由于这些物质对不同波长的光波表现出特征地吸收特性，我们通常用紫外-可见吸收光谱来检测生物分子，从而获得有关浓度和样品纯度的重要信息。

海洋光学微型光线光谱仪的微量紫外-可见分光光度计定制化（OEM）

微量紫外-可见分光光度计的研发需要经历四个阶段，分别为概念验证、原型机开发、试产及量产。海洋光学多年累积的行业经验，可以帮助客户轻松应对不同环节及阶段所面临的挑战。

图2. 海洋光学OEM流程示意

当原理性验证/概念验证完成并确认思路可行时，海洋光学依靠模块化产品，深厚光学知识，足够的适用性以及遍布全球各个行业的合作伙伴，海洋光学可以快速解决光学测量中遇到的各种挑战。从前沿应用的概念验证，到产品的规模化生产、服务，海洋在全球范围提供本地化的全面支持。海洋光学的光学，机械，电子，软件，固件和系统工程师将协助客户去集成海洋光学的产品和部件，协助客户迅速的完成原型机的设计及开发整合。

吸光度测量、定量及样品纯度判断原理

在生物样品的吸光度测量中，包括吸光度值的测量、浓度的定量以及对样品纯度的判断。

吸光度测量：

海洋光学光谱仪使用如下公式来得出每个波长处的吸光度：

其中，S_λ、D_λ和R_λ分别为波长λ处样品、背景和参考的强度。

1. aDNA和RNA都有吸收紫外线的性质，最大吸收峰在260nm波长处；紫外吸收是嘌呤环和嘧啶环的共轭双键系统所具有的性质；核酸根据其分子结构的差异，可以分为单链DNA、双链DNA以及RNA等种类，各种核酸都在260nm波长处具有最大的吸收峰。
2. 蛋白质组成中常含有络氨酸和色氨酸等芳香族氨基酸，在紫外光280nm波长处有最大吸收峰。

浓度定量：

基于比尔-朗伯定律，物质对λ波长处光的吸光度可表达如下：

其中，A_λ、ε_λ、c和L分别为波长λ处的吸光度、吸收物种的吸光系数、吸光物种的浓度和吸收路径的光程长度。

因此，在已知吸光物质的吸光系数时，可以通过吸光度的测量来推算出吸光物质的浓度。我们可以通过检测260nm、280nm处的吸光度值及比值来得到dsDNA、ssDNA和RNA等核酸以及蛋白质的含量(ng)。

样品纯度判断：

根据核酸、蛋白质在260nm、280nm处光吸收性能的差异，测量并计算得到样品在这两个波长处的吸光度的比值A260/A280，既可用于消除核酸对蛋白质测定的影响，评估核酸样品的纯度。

1. 通常纯净的核酸样品中，A260/A280的比值大于1.8（DNA）或者2.0（RNA）；当比值低于1.8或者2.0，表示存在蛋白质或者酚类物质的影响。
2. 碳水化合物、多肽和苯酚等物质在230nm处有特征的吸收，较纯净的核酸A260/A230的比值大于2.0。
3. 纯净的核酸样品在320nm处的吸光度为0，因此A320可用于检测溶液的浑浊度和其他干扰因子。

推荐配置

在生物样品的吸光度测量中，需要光源、光谱仪及采样附件。

图3. 吸光度测试典型配置示意图

以上模块化的配置，都可以被集成化，形成为一个微量紫外-可见分光光度计（如下图示例）。

图4. 标准产品测试方案与OEM方案实现的进化关系示例

微量紫外-可见分光光度计可以对需要集成的光源、光谱仪、采样附件以及仪器操作和分析软件做如下选择：

光源

1. 全波长：氙灯、氘钨灯
2. 单波长：LED光源

在用于测量吸光度的系统中，杂散光是不可避免的。抑制杂散光的一种方法是控制进入光谱仪的光，只要不用目标波长范围外的光，就能有效地减少进入光谱仪的杂散光，令线性测量范围更宽，可测量更大的吸光度。因此，光源优化是一个改善吸光度测量结果的方法。

光谱仪

适用于紫外-可见光范围吸光度测量的光谱仪主要有以下两类：

采样附件

• 微量比色皿，可实现低于2ul体积样品的采样；

图6. 微量比色皿及微量取样器

• 客户开发的采样器件。

操作及分析软件

• OceanView光谱仪操作软件

图7. OceanView软件应用测量选择界面

• Omnidriver二次开发程序包，可用于客户端进行二次分析软件的开发。