吸光度线性度有多重要？

在这篇应用中，我们评估了用于蛋白质和DNA测量的微型Ocean ST光谱仪的吸光度线性度。Ocean ST是一款最近发布的光谱仪，它紫外响应出色(185-650 nm)、信噪比高和体积小(小于智能手机)。

注： Dr. Yvette Mattley 提供了这篇应用素材。

背景

为什么要测吸光度?因为吸光度测量提供了有关材料化学成分的有价值的信息。入射到样品上的光可以被透射、吸收或散射。透射是光穿过样品，遇到分子的光被吸收或散射。吸光度可作为定性工具来识别物质，也可作为定量工具来测量溶液中分子的浓度。

吸光度是一项重要的技术，应用范围广泛，特别是在生物医学和生命科学领域，研究人员、开发人员和工艺工程师将吸光度技术应用于从蛋白质分析到POC旁床诊断等。

吸光度线性度

光谱仪测量精度的一个指标是其吸光度线性度。如比尔定律所述，给定波长吸收光的溶液将在该波长产生吸收峰，其强度随着溶液浓度的变化而线性变化。例如，如果溶液浓度加倍，吸光度峰的高度也会加倍。因此，当我们描述光谱仪具有2 AU(吸光度单位)的吸光度线性时，这表明超过2 AU，样品浓度与吸光度峰值之间的关系就失效了(不再是线性的)。这与很多因素有关，包括探测器噪声和杂散光。

具有高吸光度线性度的光谱仪允许用户1）在较宽的浓度范围内准确测量样品 2）无需对高度复杂的样品稀释，反复稀释在测量过程中存在引入误差的风险。这对于需要非常高测量精度的应用来说是至关重要的，当您想要比较一个实验与下一个实验的结果，或者当您只有有限数量的样本时。

基于Ocean ST检测蛋白质和DNA的吸光度

为评估Ocean ST的吸光度线性度，我们测量了牛血清白蛋白(BSA)和DNA寡核苷酸。牛血清白蛋白是一种常用于生化应用的蛋白质，而寡核苷酸合成DNA或RNA，广泛应用于基因检测和医学诊断等众多领域。

设备搭建

我们使用Ocean ST-UV (185-650 nm)，积分时间设置为3.8 ms，扫描平均为100，滑动平均设置为3。打开暗光谱存储和非线性校正。测量前对光谱仪和光源加热30分钟，以确保热稳定性。

下面是其他设备：

• DH-2000-S-DUV-TTL 深紫外氘卤钨光源。在这些实验中，我们只用了氘灯。所有测量时卤素灯都是关着的。
• SQ1-ALL 比色皿支架。这是一个通用的1厘米光程的比色皿支架。
• CV-Q-10 1 cm (10 mm) 光程石英比色皿。石英比色皿是紫外测量应用的绝佳选择。 
• QP450-1-XSR 抗紫外老化光纤(数量2)。450 μ m 芯径光纤，不锈钢BX护套。

样品制备和测量

我们测量了30个BSA (Sigma A2153)，浓度范围为0.02至5 mg/mL；35个寡核苷酸DNA (Sigma D-3159)浓度范围为0.3至150µg/mL。所有稀释都是直接在石英比色皿中进行的，从试管中取出0.5 mL样品，向比色皿中加入0.5 mL蒸馏水，然后通过轻轻地将样品移进和移出3次来混合样品。在测量过程中，石英比色皿没有从比色管支架上取下，这有助于最大限度地减少由污染物或比色皿对齐问题引起的误差。

实验结果

BSA的吸光度测量显示其吸光度与2 AU呈线性关系，超出了我们对Ocean ST的预期(图1)。这非常有意义，因为BSA是一种典型的蛋白质，应用于许多领域如生命科学研究和开发。

图1. Ocean ST微型光谱仪在较宽的蛋白质浓度范围内显示出显著的吸光度线性度。

通过Ocean ST对DNA寡核苷酸的测量，也获得了同样令人印象深刻的吸光度线性度结果(图2)。这表明了Ocean ST对低聚物研究的价值，低聚物作为许多分子生物学研究和开发工作的起点。对于定制低聚物生产也很有价值，紫外可见光谱被用作制造过程中量化的步骤。

图 2. Ocean ST微型光谱仪所显示的吸光度线性度通常与更复杂的光谱仪有关。